文章题目：Single-cell and spatial genomic landscape of non-small cell lung cancer brain metastases
发表期刊：Nature medicine
影响因子：50
发表时间：2025-02-27
发表单位：首都医科大学附属北京友谊医院普外科;北京市肿瘤侵袭转移研究重点实验室、国家消化系统疾病临床医学研究中心
文章背景
非小细胞肺癌（NSCLC）是脑转移（Brain Metastases, BMs）最常见的原发肿瘤类型之一，最多可达40%的NSCLC患者会发展为脑转移，且脑转移通常导致预后极差。尽管免疫治疗和靶向治疗在一定程度上改善了部分患者的生存，但对脑转移的分子机制和肿瘤微环境（TME）的理解仍非常有限。以往的研究多基于 bulk 测序或治疗后的样本，存在较大局限性：无法解析肿瘤内细胞类型的异质性；治疗会显著改变肿瘤的基因组和转录组状态；缺乏对未经治疗（treatment-naive） 样本的高分辨率多组学分析。
展开剩余92%因此，本研究旨在通过多模态单细胞技术（包括单核RNA测序、TCR测序、空转，全基因组测序及多重免疫荧光成像技术）结合大规模临床队列验证，系统揭示NSCLC脑转移的基因组不稳定性、细胞状态演变及肿瘤微环境特征，为理解其发病机制和寻找治疗靶点提供深入见解。
实验设计
1.核心研究队列（发现队列）
l样本类型：43例未经治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者样本（12例原发灶PT + 31例脑转移灶BM），涵盖2对匹配的PT-BM，用于直接对比原发与转移肿瘤的分子差异。
l技术平台：对所有样本进行10x单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）、匹配的 T 细胞受体测序（TCR-seq）、低通全基因组测序（lp-WGS）（使用IDT xGEN Stubby Adapter + UDI primer 建库）；对 14 例样本（8 例 PT、6 例 BM）额外进行空间转录组测序（Slide-seqV2）。
2.验证队列
公共数据验证：4869 例 NSCLC 患者（含 4710 例 NSCLC 的 CNA 数据、38 例及 58 例匹配 PT 与 BM 的全外显子测序（WES）数据），用于验证染色体不稳定性（CIN）特征。
Caris Life Sciences 大样本靶向测序：12575 例 NSCLC 患者（8508 例 PT、708 例 BM、3359 例颅外转移灶 ECM的WES + RNA-seq），用于验证 CIN 相关的杂合性缺失（LOH）及基因表达特征。
多重免疫荧光验证： 18 对匹配的 PT 与 BM 样本进行多重免疫荧光（mIF）（Akoya PhenoImager HT，抗体：EpCAM、cGAS、GFAP、CD8、CD163 ）染色验证，蛋白水平验证 CIN 与神经样特征。
细胞系与单细胞公共数据：Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)，192 株 NSCLC 细胞系（91 原发来源 vs 101 转移来源）、44 例 NSCLC 单细胞数据，在体外模型与独立单细胞层面验证“高 CIN+神经样程序”特征。
图1.实验设计
研究结果
一、脑转移灶具有更高的染色体不稳定性 (CIN)
作者最初分析了恶性细胞，发现原发灶（PT）和脑转移灶（BM）都显示出显着的染色体拷贝数变异（CNA），这些CNA通过lp-WGS和snRNA-seq检测结果高度一致（Pearson's R = 0.73，P = 7.8 × 10−8），脑转移灶（BM）相比原发灶（PT）表现出更高程度的染色体不稳定性（CIN）。这一结论通过多项分析得到验证：
首先，在最初的队列中，BM表现出显著更高的基因组改变比例（FGA）（图2a）和基于mRNA的CIN70评分（图2b），表明其染色体不稳定性更强。随后，这一发现在多个独立大队列中得到验证：对4,710例NSCLC的分析显示，BM是染色体不稳定性（CIN）程度更高（图2c），且CIN水平在发生转移的患者中呈渐进式升高（图2d），及在两个WES配对的PT和BM的队列中，BM同样显示出更高的FGA（图2e,f）
在12,575例患者的Caris大队列中进一步确认，BM的杂合性缺失（LOH） 水平最高，且高LOH的肿瘤比例在BM中最为富集（图2g-j）。最后，作者通过多重免疫荧光实验（Akoya Phenolmager）在蛋白水平进行了功能验证，发现BM中标志CIN的cGAS+微核发生率显著高于PT（图2k,l）。总体而言，这些分析强调 CIN 是富含 BM 的侵袭性特征。
图2. NSCLC脑转移灶（BM）的基因组不稳定性
二、脑转移癌细胞呈现“神经样”细胞状态
为了解肺癌原发灶（PT）与脑转移灶（BM）的癌细胞之间的显着转录差异。作者使用非负矩阵分解（NMF）方法系统构建了稳健的元程序（MP）。他们首先确定了142个转录程序和可解释患者内异质性的因素（图3a），进一步通过共相关分析，确定了8个复发性元程序(MPs)。每个MP均涵盖多个患者，体现出跨个体共享的分子特征（图3b），四个MP仅在BM中发现（MP4,5,7和8），并富集了CIN70基因特征的表达（图3c），而其他MPs（1,2,3和6）在PT和BM中都共同存在。为阐明 MPs 生物学功能，作者量化各MP中归一化基因的贡献（图3d），并基于癌症转录标志参考数据库（图3e）及基因集富集分析进行功能注释。结果发现，MP7和MP8表现出神经分化细胞特有的基因表达模式，与原发脑肿瘤中的神经祖细胞和少突胶质细胞祖细胞转录特征密切相关（图3e）；MP4则与标志参考文献中唯一“未分配”程序密切相关，提示其可能为BM特有状态——因为该参考数据库中未包含脑转移样本（图3e）。
作者还利用外部scRNA-seq数据集进行验证，发现这些BM特异性MPs仅富集于BM组织，而在正常肺、PT或其他颅外转移灶（ECM）中均无显著富集（图3f），表明这些MPs真正捕捉到了BM特异的细胞状态，而非一般转移特征。这些分析表明，来自非小细胞肺癌脑转移的上皮癌细胞呈现出向神经样状态分化的趋势。
图3. NSCLC 脑转移灶（BM）的癌细胞计划
三、脑转移富集的罕见癌细胞亚群
为探究是否存在跨患者共有的癌细胞状态，作者对全部恶性细胞进行了无监督聚类分析。结果显示，大多数患者呈现特异性聚类反映了预期的患者间异质性（图4a,b）。然而，其中一个被称为“cluster 21”的簇（图4a,b），虽然仅占所有恶性细胞的1.81%（共2,812个细胞），却分布于所有患者中（图4c）。在排除技术噪音及人为正常细胞污染等因素，并确认了与整体和患者特异性细胞簇一致的CNA模式（扩展数据图4a–g）。尽管cluster 21在原发灶（PT）中也有出现，但在脑转移灶（BM）中显著富集（Fisher精确检验 P < 0.001），该簇细胞表现出更高的CIN70特征，高表达上皮-间质转化调节因子（EMT，例如ZEB1、ZEB2、VIM、SPARCL1）和神经样分化标志物（如PLXDC2、PCDH9、GFAP、MBP），同时抑制上皮标志物（如NKX2-1、SFTPB、EPCAM）表达（图4c,d）。
这一特征在多个维度获得独立验证：在测序队列患者配对PT-BM样本、外部肿瘤数据集以及转移性细胞系中，cluster 21特征患者均显著富集于BM。通过多重免疫荧光成像（Akoya Phenolmager）进一步证实，约0.12%的癌细胞（EpCAM+）共表达GFAP，且绝大多数位于BM中（P = 1×10⁻⁴；图4e,f）。此外，该特征的高表达与患者较差的总生存期显著相关。为进一步理解其生物学状态，作者将癌细胞投射至正常人肺snRNA-seq细胞图谱中（图4h）。结果显示，仅17.05%的癌细胞可被归类于已知正常肺泡上皮细胞类型（AT1/AT2），绝大多数（82.95%）则暗示混合谱系程序的特征，而cluster 21细胞完全缺乏与正常细胞的相似性（图4i）。通过马尔可夫吸收概率建模，作者进一步识别出15个混合谱系癌细胞亚群（ML1–15），并根据其最大概率将它们分配到五个主要组之一。这揭示了几个与参考细胞高度对应的ML簇（例如，ML6到AT1和ML3到AT2），而其他ML簇则显示出高度的假定细胞可塑性（例如，ML2和ML4）（图4j）。综上所述，这些发现表明脑转移癌细胞不仅基因组不稳定，更倾向于获得一种神经样细胞状态，其中cluster 21代表了一种高度去分化、富含于BM中的罕见亚群，具有显著的预后意义。
图4. 发现NSCLC患者共享的恶性细胞群
四、 肿瘤微环境差异
作者对脑转移瘤（BMs）和原发性肿瘤（PTs）的肿瘤微环境（TME）进行了比较分析，他们通过单细胞测序鉴定出TME中七种非恶性细胞成分，T细胞和NK细胞（k = 28,646）、B细胞和浆细胞（k = 12,110）、髓系细胞（k = 25,741）、内皮细胞（k = 5,164）、基质和成纤维细胞（k = 15,412）、中枢神经系统（CNS）细胞（k = 17,941）以及其他细胞（图5a），这些细胞共占测序队列的44.16%。在T和NK细胞群体中（图5b），作者进一步鉴定出多个亚群，包括调节性T细胞（Treg）、辅助T细胞、NK细胞、不同分化状态的CD8+ T细胞等。值得注意的是，与PTs相比，BMs中CD8+ T细胞（包括活化、分化和效应记忆等状态）显著减少，而抑制性Treg细胞、幼稚T细胞和NK细胞则相对富集（图5c）。免疫组化结果也验证了BMs中CD8+ T细胞浸润较低（图5d,e）。在髓系细胞中，他们识别出包括单核/巨噬细胞、粒细胞、中性粒细胞、小胶质细胞以及树突状细胞等多个亚群（图5g）。PTs的髓系成分以肺泡巨噬细胞（AM）为主，而BMs则包含更多来源各异的髓系细胞，包括单核细胞来源的髓系细胞、粒细胞/中性粒细胞以及小胶质细胞等（图5h）。此外，BMs中巨噬细胞表现出更高的CD163蛋白表达（图5j），提示其可能具有更显著的促肿瘤表型。
在中枢神经系统（CNS）细胞中，作者回收了17,941个细胞转录组，包括六个主要亚群，包括少突胶质细胞（k = 8,245），兴奋性（k = 3,360）和抑制性神经元（k = 1,463），星形胶质细胞（k = 3,034），少突胶质细胞前体细胞（k = 1,391）和松核细胞（k = 448）（图5k）。通过细胞互作分析（ContactTracing），发现了BM 生态位中存在髓系细胞表达的PECAM1与CNS细胞表达的CD38之间的互作，可能调节血管通透性并促进免疫抑制（图5l）。此外，CNS细胞与恶性细胞之间的互作富集于上皮间质转化（EMT）、血管生成和低氧等相关通路，而IL-6/JAK/STAT3信号在生态位细胞与T细胞之间显著激活，可能共同塑造了一个促肿瘤微环境。综上所述，这项研究系统揭示了脑转移瘤与原发性肿瘤在TME组成和细胞状态上的显著差异，突出了BMs中CD8+ T细胞功能障碍、髓系细胞多样性以及 CNS 生态位细胞通过特定信号通路促进免疫抑制和肿瘤进展的作用。
图5.NSCLC脑转移灶（BM）的肿瘤免疫景观
五、空间异质性分析
作者对14例样本（包括8例原发性肿瘤（PTs）和6例脑转移瘤（BMs））进行了空间转录组（ST）分析（图6a, b）。恶性细胞及肿瘤微环境组成在snRNA-seq与匹配的ST数据间高度一致（图6c）。表达cluster 21特征基因的细胞显著富集于血管周围区域（图6d–g），且与CIN70特征表达呈强相关（Pearson’s R = 0.68，P = 7.2×10⁻³），进一步支持该类细胞可能代表高转移性亚群（图6p）。通过无偏性空间差异表达分析发现，PTs中谱系基因（如SFTPB、SFTPC）相对保守，而在BMs中保守性降低；BMs中多样基因程序（包括MYC通路与炎症小体相关基因）的空间变异有限。与之前研究一致，在11例样本中识别出B细胞与浆细胞离散聚集区。基于髓系细胞在PTs与BMs中的分布差异，研究员进一步以髓系细胞密度作为空间协变量，识别高/低浸润区域（图6h,i,l,m），并分析其对癌细胞基因表达的影响。BMs中髓系细胞高浸润区域与MYC靶基因、TGF-β信号及上皮间质转化（EMT）激活相关；而在PTs中，同类区域则富集干扰素反应、抗原呈递与代谢通路（图6j,k,n,o）。两者共有的高表达基因包括染色质调控因子（ARL14EP）、EMT相关基因（COL1A1/2）、促肿瘤基因（LTBR、NBR1）及代谢凋亡相关基因（FDFT1、TMBIM1）等。BMs特异性基因包括EMT主调控因子SOX4、线粒体呼吸链复合物基因（NDUFA1、NDUFB1）、甲羟戊酸代谢基因MTDH以及表观调控因子NSD1。
图6.NSCLC 脑转移灶（BM）的空间景观
总结
本研究通过整合多模态前沿技术，系统揭示了非小细胞肺癌（NSCLC）脑转移的分子与细胞生态机制。团队采用单核RNA测序（snRNA-seq） 与T细胞受体测序（TCR-seq） 解析细胞组成与免疫谱系，利用低深度全基因组测序（lp-WGS） 辅以IDT xGEN文库构建技术全面评估染色体不稳定性（CIN），并通过Slide-seqV2空间转录组绘制细胞空间互作图谱，关键发现经由Akoya PhenoImager多色荧光成像平台在独立队列中予以验证。
参考文献：
【1】Tagore S, Caprio L, Amin AD, Bestak K, Luthria K, D'Souza E, Barrera I, Melms JC, Wu S, Abuzaid S, Wang Y, Jakubikova V, Koch P, Brodtman DZ, Bawa B, Deshmukh SK, Ebel L, Ibarra-Arellano MA, Jaiswal A, Gurjao C, Biermann J, Shaikh N, Ramaradj P, Georgis Y, Lagos GG, Ehrlich MI, Ho P, Walsh ZH, Rogava M, Politis MG, Biswas D, Cottarelli A, Rizvi N, Shu CA, Herzberg B, Anandasabapathy N, Sledge G, Zorn E, Canoll P, Bruce JN, Rizvi NA, Taylor AM, Saqi A, Hibshoosh H, Schwartz GK, Henick BS, Chen F, Schapiro D, Shah P, Izar B. Single-cell and spatial genomic landscape of non-small cell lung cancer brain metastases. Nat Med. 2025 Apr;31(4):1351-1363. doi: 10.1038/s41591-025-03530-zIF: 50.0 Q1 . Epub 2025 Feb 27. PMID: 40016452; PMCID: PMC12323702.
文案：李秋燕
图片来源：图片均来源于参考文献
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